Badanie ANA ma podstawowe znaczenie w diagnostyce chorób autoimmunologicznych. Swoiste przeciwciała ANA mogą być obecne we krwi pacjenta przed wystąpieniem objawów chorobowych i w pewnych sytuacjach mogą stanowić źródło informacji na temat prawdopodobieństwa wystąpienia objawów bądź powikłań. Oficjalne rekomendacje jednoznacznie zalecają dwuetapową diagnostykę przeciwciał ANA. Pierwszym etapem badanie ANA jest test przesiewowy – immunofluorescencja pośrednia (IIFT) z wykorzystaniem jako substratu komórek HEp-2. Wynikiem testu przesiewowego jest obraz mikroskopowy komórek wskazujący konkretny typ fluorescencji. Wynik ujemny IIFT jest ostateczny, podczas gdy wszystkie wyniki pozytywne należy potwierdzić drugą niezależną metodą. Drugi etap diagnostyki opiera się o testy monospecyficzne (typu ELISA czy ImmunoBlot), w których oznacza się specyficzność antygenową badanych przeciwciał. W diagnostyce ANA bardzo ważne jest sprawdzenie, czy otrzymane wyniki ze sobą korelują. Mówiąc prościej, przed wydaniem wyniku ostatecznego należy sprawdzić czy wynik testu monospecyficznego zgodny jest z odpowiednim typem fluorescencji uzyskanym na etapie badania IIFT.
Immunofluorescencja pośrednia (badanie ANA cz. 1)
Immunofluorescencja pośrednia (IIFT, ang. indirect immunofluorescence technique) jest najczęściej stosowaną metodą przesiewową w diagnostyce chorób autoimmunologicznych. W przypadku IIFT na szkiełku mikroskopowym znajduje się substrat (antygen), który służy do wykrywania swoistych przeciwciał krążących w surowicy pacjenta. Substratem do analizy IIFT mogą być:
- rozmazy komórkowe
- skrawki tkanek
- wysokooczyszczone antygeny monospecyficzne
Technika ta charakteryzuje się bardzo dobrą czułością i dlatego jest bardzo często metodą pierwszego wyboru. Immunofluorescencja pośrednia z zastosowaniem komórek HEp-2 (ang. human epithelial cell line, type 2) stanowi złoty standard w diagnostyce przeciwciał przeciwjądrowych (ANA, ang. anti-nuclear antibodies), które mają podstawowe znaczenie w diagnostyce chorób autoimmunologicznych. ANA inkubowane z substratem antygenowym dają różne typy fluorescencji, w zależności od lokalizacji antygenu, przeciw któremu są skierowane.
IIFT stanowi pierwszy etap badanie ANA, dostarcza ważnych informacji na temat swoistości przeciwciał. Po określeniu typu świecenia oraz miana przeciwciał (wynik półilościowy) dalsza ich identyfikacja (potwierdzenie i różnicowanie) prowadzona jest za pomocą testów monospecyficznych (ELISA, Blot).
Zasada działania testu
- W pierwszym etapie badania diagnosta nanosi na substrat odpowiednio rozcieńczoną surowicę pacjenta. Jeżeli w badanej próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, dochodzi wówczas do reakcji przeciwciało-antygen.
- W drugim etapie dodawany jest roztwór przeciwciał antyludzkich znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym (izotiocyjanianem fluoresceiny – FITC), zwany powszechnie koniugatem.
- W efekcie pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuje się charakterystyczne wzory fluorescencji. Typ świecenia zależy od morfologicznej lokalizacji docelowego antygenu.